Микроклональные растения что это
Перейти к содержимому

Микроклональные растения что это

  • автор:

Микроклональное размножение растений

Для семенных растений характерно два способа размножения: семенной и вегетативный. Оба эти способа имеют как преимущества, так и недостатки. К недостаткам семенного размножения следует отнести, в первую очередь, генетическую пестроту получаемого посадочного материалa и длительность ювенильного периода. При вегетативном размножении сохраняется генотип материнского растения и сокращается продолжительность ювенильного периода. Однако для большинства видов (в первую очередь для древесных пород) проблема вегетативного размножения остается до конца не решенной. Это обусловлено следующими причинами:

  • не все породы, даже на ювенильной стадии, могут размножаться вегетативным способом с требуемой эффективностью (дуб, сосна, ель, орехоплодные и др.);
  • практически невозможно с помощью черенкования размножать многие виды древесных пород в возрасте старше 10—15 лет;
  • не всегда удается получать стандартный посадочный материал (возможность накопления и передачи инфекции);
  • трудоемкостью и сложностью операций при размножении взрослых (древесных) растений с помощью прививок;
  • неэффективностью разработанных технологий для получения достаточного количества генетически однородного материала в течение года.

Достижения в области культуры клеток и тканей привели к созданию принципиально нового метода вегетативного размножения — клонального микроразмножения (получение в условиях in vitro (в пробирке), неполовым путем растений, генетически идентичных исходному экземпляру). В основе метода лежит уникальная способность растительной клетки реализовывать присущую ей тотипотентность, то есть под влиянием экзогенных воздействий давать начало целому растительному организму. Этот метод, несомненно, имеет ряд преимуществ перед существующими традиционными способами размножения:

  • получение генетически однородного посадочного материала;
  • освобождение растений от вирусов за счет использования меристемной культуры;
  • высокий коэффициент размножения (105—106 — для травянистых, цветочных растений, 104—105 — для кустарниковых древесных, 104 — для хвойных);
  • сокращение продолжительности селекционного процесса;
  • ускорение перехода растений от ювенильной к репродуктивной фазе развития;
  • размножение растений, трудно размножаемых традиционными способами;
  • возможность проведения работ в течение года и экономия площадей, необходимых для выращивания посадочного материала;

Первые достижения в области клонального микроразмножения были получены в конце 50-х годов XX столетия французским ученым Жоржем Морелем, которому удалось получить первые растения-регенеранты орхидей. Успеху Ж. Мореля в микроразмножении способствовала уже разработанная к тому времени техника культивирования апикальной меристемы растений в условиях in vitro. Как правило, исследователи в качестве первичного экспланта использовали верхушечные меристемы травянистых растений: гвоздики, хризантемы, подсолнечника, гороха, кукурузы, одуванчика, салата и изучали влияние состава питательной среды на процессы регенерации и формирования растений. Ж. Морель в своих работах также использовал верхушку цимбидиума (сем. орхидные) состоящую из конуса нарастания и двух-трех листовых зачатков, из которой при определенных условиях наблюдал образование сферических сфер — протокормов. Сформировавшиеся протокормы можно было делить и затем культивировать самостоятельно на вновь приготовленной питательной среде до образования листовых примордиев и корней. В результате им было обнаружено, что этот процесс бесконечен и можно было получать в большом количестве высококачественный и генетически однородный, безвирусный посадочный материал.

В России работы по клональному микроразмножению были начаты в 60-х годах в лаборатории культуры тканей и морфогенеза Института физиологии растений им. К. А. Тимирязева РАН. Под руководством чл.-корр. РАН, академика РАСХН Бутенко Р. Г. были изучены условия микроразмножения картофеля, сахарной свеклы, гвоздики, герберы, фрезии и некоторых других растений и предложены промышленные технологии. Таким образом, первые успехи в клональном микроразмножении связаны с культивированием апикальных меристем травянистых растений на соответствующих питательных средах, обеспечивающих в конечном итоге получение растений-регенерантов.

Однако область применения микроразмножения разнообразна и имеет тенденцию к постоянному расширению. Это в первую очередь относится к размножению in vitro взрослых древесных пород, особенно хвойных, и использование техники in vitro для сохранения редких и исчезающих видов лекарственных растений. В настоящее время в этом направлении наметился положительный сдвиг.

Первые работы по культуре тканей древесных растений были опубликованы в середине 20-х годов XX столетия и связаны с именем французского ученого Готре. В них сообщалось о способности камбиальных тканей некоторых видов вяза и сосны к каллусогенезу in vitro. В последующих работах 40-х годов было выяснено о способности различных тканей вяза листового к образованию адвентивных почек. Однако дальнейший рост и формирование побегов авторами не были получены. Лишь к середине 60-х годов Матесу удалось получить первые растения-регенеранты осины, которые были доведены до почвенной культуры. Культивирование тканей хвойных город in vitro долгое время использовалось как объект исследования. Это было связано со специфическими трудностями культивирования ювенильных и тем более взрослых тканей, изолированных с растения. Известно, что древесные, и особенно хвойные, характеризуются медленным ростом, трудно укореняются, содержат большое количество вторичных соединений (фенолы, терпены и другие вещества), которые в изолированных тканях окисляются различными фенолазами. В свою очередь, продукты окисления фенолов обычно ингибируют деление и рост клеток что ведет к гибели первичного экспланта или к уменьшению способности тканей древесных пород к регенерации адвентивных почек которая с возрастом растения-донора постепенно исчезает полностью. Однако, несмотря на все трудности, ученые все чаще используют в качестве объектов исследований различные ткани и органы древесных растений В настоящее время насчитывается более 200 видов древесных растений из 40 семейств, которые были размножены in vitro (каштан, дуб, береза, клен, осина, гибриды тополей с осиной, сосна, ель, секвойя и др.), а работы в этом направлении ведутся в научных учреждениях Москвы, Санкт-Петербурга, Воронежа, Уфы, Новосибирска, Архангельска, Киева, Одессы, Ялты и др.

Этапы и методы клонального микроразмножения

Процесс клонального микроразмножения можно разделить на четыре этапа:

  • выбор растения-донора, изолирование эксплантов и получение хорошо растущей стерильной культуры;
  • собственно микроразмножение, когда достигается получение максимального количества мериклонов;
  • укоренение размноженных побегов с последующей адаптацией их к почвенным условиям, а при необходимости депонирование растений-регенерантов при пониженной температуре (+ 2°, + 10 °C);
  • выращивание растений в условиях теплицы и подготовка их к реализации или посадке в поле.

Ссылки

  • http://www.biotechnolog.ru/
  • http://bio-technology.nm.ru/micropropogation.htm
  • http://molbiol.ru/forums/index.php?showtopic=211150

Литература

  • Бутенко Р. Г. Биология культивируемых клеток высших растений in vitro и биотехнологии на их основе, Монография. — Москва, ФБК-Пресс, 1999. — 159 с.
  • Катаева Н. В., Бутенко Р. Г. Клональное микроразмножение растений. — М., 1983.
  • Культура клеток растений. / под ред. Р. Г. Бутенко. М., 1986.

Микроклонирование

Микроклонирование

Микроклонирование – это технология выращивания и размножения растений в условиях лаборатории. Несмотря на отдаление от классического представления размножения культур, микроклонирование заслуженно завоевало популярность среди растениеводов. Используя небольшую посадочную площадь, стало возможным выведение объемного количества растений, что экономит пространство. Способ широко применим и для выведения гибридов различных растений. Размножение микроклонированием гарантирует генетическую сохранность и исключает вредоносные бактерии и микрофлору, которая могла бы пагубно повлиять на растение.

Средний рейтинг
4 из 5 звезд. 1 голосов.
Вам нужно авторизироваться для того, чтобы проголосовать.

Размножение растений

Предыдущая запись

Микроклональное размножение

Следующая запись

  • Новосибирская лаборатория клонального микроразмножения
  • Меристема
  • Растения в кассетах
  • Адаптированные растения exvitro
  • In vitro метод

Свежие комментарии
© 2024 СибБиоТех · Меристемные растения

Наша специализация – массовое производство высококачественного посадочного материала с помощью клонального микроразмножения.

Тема от GoodwinPress.ru

Микроклональное размножение растений

Для семенных растений характерно два способа размножения: семенной и вегетативный. Оба эти способа имеют как преимущества, так и недостатки. К недостаткам семенного размножения следует отнести, в первую очередь, генетическую пестроту получаемого посадочного материалa и длительность ювенильного периода. При вегетативном размножении сохраняется генотип материнского растения и сокращается продолжительность ювенильного периода. Однако для большинства видов (в первую очередь для древесных пород) проблема вегетативного размножения остается до конца не решенной.

Это обусловлено следующими причинами:

Достижения в области культуры клеток и тканей привели к созданию принципиально нового метода вегетативного размножения — клонального микроразмножения (получение в условиях in vitro (в пробирке), неполовым путем растений, генетически идентичных исходному экземпляру). В основе метода лежит уникальная способность растительной клетки реализовывать присущую ей тотипотентность, то есть под влиянием экзогенных воздействий давать начало целому растительному организму.

Этот метод, несомненно, имеет ряд преимуществ перед существующими традиционными способами размножения:

Первые достижения в области клонального микроразмножения были получены в конце 50-х годов XX столетия французским ученым Жоржем Морелем, которому удалось получить первые растения-регенеранты орхидей. Успеху Ж. Мореля в микроразмножении способствовала уже разработанная к тому времени техника культивирования апикальной меристемы растений в условиях in vitro. Как правило, исследователи в качестве первичного экспланта использовали верхушечные меристемы травянистых растений: гвоздики, хризантемы, подсолнечника, гороха, кукурузы, одуванчика, салата и изучали влияние состава питательной среды на процессы регенерации и формирования растений. Ж. Морель в своих работах также использовал верхушку цимбидиума (сем. орхидные) состоящую из конуса нарастания и двух-трех листовых зачатков, из которой при определенных условиях наблюдал образование сферических сфер — протокормов. Сформировавшиеся протокормы можно было делить и затем культивировать самостоятельно на вновь приготовленной питательной среде до образования листовых примордиев и корней. В результате им было обнаружено, что этот процесс бесконечен и можно было получать в большом количестве высококачественный и генетически однородный, безвирусный посадочный материал.

В России работы по клональному микроразмножению были начаты в 60-х годах в лаборатории культуры тканей и морфогенеза Института физиологии растений им. К. А. Тимирязева РАН. Под руководством чл.-корр. РАН, академика РАСХН Бутенко Р. Г. были изучены условия микроразмножения картофеля, сахарной свеклы, гвоздики, герберы, фрезии и некоторых других растений и предложены промышленные технологии. Таким образом, первые успехи в клональном микроразмножении связаны с культивированием апикальных меристем травянистых растений на соответствующих питательных средах, обеспечивающих в конечном итоге получение растений-регенерантов.

Однако область применения микроразмножения разнообразна и имеет тенденцию к постоянному расширению. Это в первую очередь относится к размножению in vitro взрослых древесных пород, особенно хвойных, и использование техники in vitro для сохранения редких и исчезающих видов лекарственных растений. В настоящее время в этом направлении наметился положительный сдвиг.

Первые работы по культуре тканей древесных растений были опубликованы в середине 20-х годов XX столетия и связаны с именем французского ученого Готре.

В них сообщалось о способности камбиальных тканей некоторых видов вяза и сосны к каллусогенезу in vitro. В последующих работах 40-х годов было выяснено о способности различных тканей вяза листового к образованию адвентивных почек. Однако дальнейший рост и формирование побегов авторами не были получены. Лишь к середине 60-х годов Матесу удалось получить первые растения-регенеранты осины, которые были доведены до почвенной культуры. Культивирование тканей хвойных город in vitro долгое время использовалось как объект исследования. Это было связано со специфическими трудностями культивирования ювенильных и тем более взрослых тканей, изолированных с растения. Известно, что древесные, и особенно хвойные, характеризуются медленным ростом, трудно укореняются, содержат большое количество вторичных соединений (фенолы, терпены и другие вещества), которые в изолированных тканях окисляются различными фенолазами. В свою очередь, продукты окисления фенолов обычно ингибируют деление и рост клеток что ведет к гибели первичного экспланта или к уменьшению способности тканей древесных пород к регенерации адвентивных почек которая с возрастом растения-донора постепенно исчезает полностью. Однако, несмотря на все трудности, ученые все чаще используют в качестве объектов исследований различные ткани и органы древесных растений В настоящее время насчитывается более 200 видов древесных растений из 40 семейств, которые были размножены in vitro (каштан, дуб, береза, клен, осина, гибриды тополей с осиной, сосна, ель, секвойя и др.), а работы в этом направлении ведутся в научных учреждениях Москвы, Санкт-Петербурга, Воронежа, Уфы, Новосибирска, Архангельска, Киева, Одессы, Ялты и др.

Этапы микроклонального размножения растений.

Процесс клонального микроразмножения можно разделить на 4 этапа:

  1. Выбор растения-донора, изолирование эксплантов и получение хорошо растущей стерильной культуры.
  2. Собственно микроразмножение, когда достигается получение максимального количества меристематических клонов.
  3. Укоренение размноженных побегов с последующей адаптацией их к почвенным условиям, а при необходимости депонирование растений-регенерантов при пониженной температуре (+2оС, +10оС).
  4. Выращивание растений в условиях теплицы и подготовка их к реализации или посадке в поле.

Для культивирования тканей на каждом из четырех этапов требуется применение определенного состава питательной среды.

На первом этапе необходимо добиться получения хорошо растущей стерильной культуры. В тех случаях, когда трудно получить исходную стерильную культуру экспланта, рекомендуется вводить в состав питательной среды антибиотики (тетрациклин, бензилпенициллин и др.) в концентрации 100—200 мг/л. Это в первую очередь относится к древесным растениям, у которых наблюдается тенденция к накоплению внутренней инфекции.

На первом этапе, как правило, используют среду, содержащую минеральные соли по рецепту Мурасига и Скуга, а также различные биологически активные вещества и стимуляторы роста (ауксины, цитокинины) в различных сочетаниях в зависимости от объекта. В тех случаях, когда наблюдается ингибирование роста первичного экспланта, за счет выделения им в питательную среду токсичных веществ (фенолов, терпенов и других вторичных соединений), снять его можно, используя антиоксиданты. Это возможно двумя способами: либо омывкой экспланта слабым его раствором в течение 4—24 ч, либо непосредственным добавлением в питательную среду. В качестве антиоксидантов используют: аскорбиновую кислоту (1 мг/л), глютатион (4—5 мг/л), дитиотриэтол (1—3 мг/л), диэтилдитиокарбомат (2—5 мг/л), поливинилпирролидон (5000—10000 мг/л). В некоторых случаях целесообразно добавлять в питательную среду адсорбент — древесный активированный уголь в концентрации 0,5—1%. Продолжительность первого этапа может колебаться от 1 до 2 месяцев, в результате которого наблюдается рост меристематических тканей и формирование первичных побегов.

2 этап — собственно микроразмножение. На этом этапе необходимо добиться получения максимального количества мериклонов, учитывая при этом, что с увеличением субкультивирований увеличивается число растений-регенерантов с ненормальной морфологией и возможно наблюдать образование растений-мутантов.

Как и на первом этапе, используют питательную среду по рецепту Мурасига и Скуга, содержащую различные биологически активные вещества, а также регуляторы роста. Основную роль при подборе оптимальных условий культивирования эксплантов играют соотношение и концентрация внесенных в питательную среду цитокининов и ауксинов. Из цитокининов наиболее часто используют БАП в концентрациях от 1 до 10 мг/л, а из ауксинов—ИУК и НУК в концентрациях до 0,5 мг/л.

При долгом культивировании растительных тканей на питательных средах с повышенным содержанием цитокининов (5—10 мг/л) происходит постепенное накопление их в тканях выше необходимого физиологического уровня, что приводит к появлению токсического действия и формированию растений с измененной морфологией. Вместе с тем, возможно наблюдать такие нежелательные для клонального микроразмножения эффекты, как подавление пролиферации пазушных меристем, образование витрифицированных (оводненных) побегов и уменьшение способности растений к укоренению. Отрицательное действие цитокининов возможно преодолеть, по данным Н.В. Катаевой и Р.Г. Бутенко, путем использования питательных сред с минимальной концентрацией цитокининов, обеспечивающих стабильный коэффициент микроразмножения, или путем чередования циклов культивирования на средах с низким и высоким уровнем фитогормонов.

3 и 4 этапы — укоренение микропобегов, их последующая адаптация к почвенным условиям и высадка в поле являются наиболее трудоемкими этапами, от которых зависит успех клонального микроразмножения. На третьем этапе, как правило, меняют основной состав среды: уменьшают в два, а иногда и в четыре раза концентрацию минеральных солей по рецепту Мурасига и Скуга или заменяют ее средой Уайта, уменьшают количество сахара до 0,5—1% и полностью исключают цитокинины, оставляя один лишь ауксин. В качестве стимулятора корнеобразования используют β-индолил-3-масляную кислоту (ИМК), ИУК или НУК.

Укоренение микропобегов проводят двумя способами:

Пересадка растений-регенерантов в субстрат является ответственным этапом, завершающим процесс клонального микроразмножения. Наиболее благоприятное время для пересадки пробирочных растений — весна или начало лета.

Растения с двумя-тремя листьями и хорошо развитой корневой системой осторожно вынимают из колб или пробирок пинцетом с длинными концами или специальным крючком. Корни отмывают от остатков агара и высаживают в почвенный субстрат, предварительно простерилизованный при 85—90° С в течение 1—2 ч. Для большинства растений в качестве субстратов используют торф, песок (3:1); торф, дерновую почву, перлит (1:1:1); торф, песок, перлит (1:1:1). Исключение составляют семейство орхидных, для которых готовят субстрат, состоящий из сфагнового мха, смеси торфа, листьев бука или дуба, сосновой коры (1:1:1).

Приготовленным заранее почвенным субстратом заполняют пикировочные ящики или торфяные горшочки, в которых выращивают растения-регенеранты. Горшочки с растениями помещают в теплицы с регулируемым температурным режимом (20—22° С), освещенностью не более 5 тыс. лк и влажностью 65—90%. Для лучшего роста растений создают условия искусственного тумана. В тех случаях, когда нет возможности создать такие условия, горшочки с растениями накрывают стеклянными банками или полиэтиленовыми пакетами, которые постепенно открывают до полной адаптации растений.

Через 20—30 дней после посадки хорошо укоренившиеся растения подкармливают растворами минеральных солей Кнудсона, Мурасига и Скуга, Чеснокова, Кнопа (в зависимости от вида растений) или комплексным минеральным удобрением. По мере роста растений их рассаживают в большие емкости со свежим субстратом. Дальнейшее выращивание акклиматизированных растений соответствует принятой агротехнике выращивания для каждого индивидуального вида растений.

Процесс адаптации пробирочных растений к почвенным условиям является наиболее дорогостоящей и трудоемкой операцией. Нередко после пересадки растений в почву наблюдается остановка в росте, опадение листьев и гибель растений. Эти явления связаны, в первую очередь, с тем, что у пробирочных растений нарушена деятельность устьичного аппарата, вследствие чего происходит потеря большого количества воды. Во-вторых, у некоторых растений в условиях in vitro не происходит образования корневых волосков, что приводит, в свою очередь, к нарушению поглощения воды и минеральных солей из почвы. Поэтому целесообразно на третьем или четвертом этапах клонального микроразмножения применять искусственную микоризацию растений (для микотрофных), учитывая их положительную роль в снабжении растений минеральными и органическими питательными веществами, водой, биологически активными веществами, а также в защите растений от патогенов.

Индийскими учеными предложен простой метод предотвращения быстрого обезвоживания листьев растений, выращенных in vitro, во время их пересадки в полевые условия. Метод заключается в том, что листья в течение всего акклиматизационного периода следует опрыскивать 50%-ным водным раствором глицерина или смесью парафина, или жира в диэтиловом эфире (1:1). Применение этого метода помогает избежать длинных и затруднительных процессов закаливания пробирочных растений и обеспечивает 100%-ную их приживаемость.

Методы клонального микроразмножения.

Существует много методов клонального микроразмножения, а также различных их классификаций. Согласно одной из них, предложенной Мурасиге в 1977 году, процесс можно осуществлять следующими путями:

    1. Активация пазушных меристем.
    2. Образование адвентивных побегов тканями экспланта.
    3. Возникновение адвентивных побегов в каллусе.
    4. Индукция соматического эмбриогенеза в клетках экспланта.
    5. Соматический эмбриогенез в каллусной ткани.
    6. Формирование придаточных эмбриоидов в ткани первичных соматических зародышей (деление первичных эмбриоидов).

Н. В. Катаева и Р. Г. Бутенко (1983) выделяют два принципиально различных типа клонального микроразмножения:

  • Активация уже существующих в растении меристем (апекс стебля, пазушные и спящие почки стебля).
  • Индукция возникновения почек или эмбриоидов de novo:
    1. образование адвентивных побегов непосредственно тканями экспланта;
    2. индукция соматического эмбриогенеза;
    3. дифференциация адвентивных почек в первичной и пересадочной каллусной ткани.

Основной метод, использующийся при клональном микроразмножении растений — активация развития уже существующих в растении меристем. Он основан на снятии апикального доминирования.

Этого можно достичь двумя путями:

Схема размножения растений методом активации уже существующих меристем (по А. Р. Родину, Е. А. Калашниковой, 1993): 1 – путем удаления верхушечной меристемы: 2 – добавлением цитокининов в среду (б/г – среда без гормонов, Ц – цитокинин, А – ауксин)

Образование корней побегами розы при добавлении в питательную среду 2 мг/л 2,4-Д

Полученные таким образом побеги отделяют от первичного экспланта и вновь самостоятельно культивируют на свежеприготовленной питательной среде, стимулирующей пролиферацию пазушных меристем и возникновение побегов более высоких порядков.

Часто в качестве экспланта используют верхушечные или пазушные почки, которые изолируют из побега и помещают на питательную среду с цитокининами.

Образующиеся пучки побегов делят, при необходимости черенкуют и переносят на свежую питательную среду. После нескольких пассажей, добавляя в питательную среду ауксины, побеги укореняют in vitro, а затем переносят в почву, где создают условия, способствующие адаптации растений.

Адаптация пробирочных роз к почвенным условиям.

В настоящее время этот метод широко используется в производстве посадочного материала сельскохозяйственных культур, как технических, так и овощных, а также для размножения культур промышленного цветоводства (например, гвоздики), тропических и субтропических растений, плодовых и ягодных культур, древесных растений.

Для некоторых культур, таких как картофель, технология клонального размножения поставлена на промышленную основу.

Применение метода активации развития существующих меристем позволяет получать из одной меристемы картофеля более 100000 растений в год, причем технология предусматривает получение в пробирках микроклубней — ценного безвирусного семенного материала.

Второй метод — индукция возникновения адвентивных почек непосредственно тканями экспланта. Он основан на способности изолированных частей растения при благоприятных условиях питательной среды восстанавливать недостающие органы и таким образом регенерировать целые растения.

Можно добиться образования адвентивных почек почти из любых органов и тканей растения (изолированного зародыша, листа, стебля, семядолей, чешуек и донца луковиц, сегментов корней и зачатков соцветий).

Этот процесс происходит на питательных средах, содержащих цитокинины в соотношении с ауксинами 10:1 или 100:1. В качестве ауксина используют ИУК или НУК.

Таким способом были размножены многие представители семейства лилейных, томаты, древесные растения (из зрелых и незрелых зародышей).

Достаточно хорошо разработана технология клонального размножения земляники, основанная на культивировании апикальных меристем. Меристематические верхушки изолируют из молодых, свободных от вирусных болезней растений, и выращивают на питательной среде МС, содержащей БАП в концентрации 0,1 — 0,5 мг/л. Через 3 — 4 недели культивирования меристема развивается в проросток, в основании которого формируются адвентивные почки, быстро растущие и дающие начало новым почкам. В течение 6-8 недель образуется конгломерат почек, связанных между собой соединительной тканью и находящихся на разной стадии развития. Появляются листья на коротких черешках, в нижней части которых формируются новые адвентивные почки. Эти почки разделяют и пересаживают на свежую питательную среду. На среде без регуляторов роста за 4 — 5 недель формируются нормальные растения с корнями и листьями. От одного материнского растения таким образом можно получить несколько миллионов растений-регенерантов в год.

Третий метод, практикуемый при клональном микроразмножении, основывается на дифференциации из соматических клеток зародышеподобных структур, которые по своему виду напоминают зиготические зародыши. Этот метод получил название соматического эмбриогенеза.

В отличие от развития in vivo, соматические зародыши развиваются асексуально вне зародышевого мешка и по своему внешнему виду напоминают биполярные структуры, у которых одновременно наблюдается развитие апикальных меристем стебля и корня. Согласно Стеварду, соматические зародыши проходят 3 стадии развития: глобулярную, сердцевидную, торпедовидную и в конечном итоге имеют тенденцию развития в проросток.

На рисунке показан конечный результат развития – растение пшеницы.

Оригинал статьи смотрите по ссылке.

МИКРОКЛОНАЛЬНОЕ РАЗМНОЖЕНИЕ РАСТЕНИЙ Текст научной статьи по специальности «Биологические науки»

Аннотация научной статьи по биологическим наукам, автор научной работы — Демидчик Вадим Викторович, Черныш Мария Александровна, Дитченко Татьяна Ивановна, Спиридович Елена Владимировна, Пржевальская Дарья Андреевна

В статье обобщены научные принципы, достижения и факторы, лимитирующие использование микроклонального размножения растений.

i Надоели баннеры? Вы всегда можете отключить рекламу.

Похожие темы научных работ по биологическим наукам , автор научной работы — Демидчик Вадим Викторович, Черныш Мария Александровна, Дитченко Татьяна Ивановна, Спиридович Елена Владимировна, Пржевальская Дарья Андреевна

Особенности микроклонального размножения косточковых культур в условиях in vitro
ЛЕСНАЯ БИОТЕХНОЛОГИЯ
МИКРОКЛОНАЛЬНОЕ РАЗМНОЖЕНИЕ ПЛОДОВЫХ КУЛЬТУР (ОБЗОР)

Перспективная технология размножения платана испанского для зеленого строительства на юго-западе Ростовской области

ДЕПОНИРОВАНИЕ НАЦИОНАЛЬНОЙ КОЛЛЕКЦИИ КАРТОФЕЛЯ
i Не можете найти то, что вам нужно? Попробуйте сервис подбора литературы.
i Надоели баннеры? Вы всегда можете отключить рекламу.

Microclonal propagation of plants

The article summarizes the scientific principles, achievements and factors limiting the use of microclonal propagation of plants.

Текст научной работы на тему «МИКРОКЛОНАЛЬНОЕ РАЗМНОЖЕНИЕ РАСТЕНИЙ»

декан биологического факультета БГУ, доктор биологических наук, доцент

научный сотрудник и аспирант кафедры клеточной биологии и биоинженерии растений биологического факультета БГУ

доцент кафедры клеточной биологии и биоинженерии растений биологического факультета БГУ, кандидат биологических наук, доцент

заведующая лабораторией прикладной биохимии Центрального ботанического сада НАН Беларуси, кандидат биологических наук, доцент

научный сотрудник кафедры клеточной биологии и биоинженерии растений биологического факультета БГУ

заведующий лабораторией генетики и биотехнологии Института леса НАН Беларуси, член-корреспондент НАН Беларуси, доктор биологических наук, доцент

Аннотация. В статье обобщены научные принципы, достижения и факторы, лимитирующие использование микроклонального размножения растений. Ключевые слова: микроклональное размножение, вегетативное клонирование, эксплант, культура in vitro, высшие растения, фитогормоны, биотехнология растений, стерильные условия.

реди важнейших областей современной биотехнологии особое место занимает

^^^^^ размножение растений, находящее широкое практическое приложение: от фундаментальных научных исследований до производства посадочного материала сельскохозяйственных растений и лесных пород деревьев [1, 3, 5, 6, 11, 14]. Для этого используются небольшие образцы растительного материала, обычно содержащие меристематические клетки — экспланты; в результате из одного небольшого растения или его части можно получить

множество микроклонов — миниатюрных копий оригинального организма [2-4, 14, 15].

Исторически техника подобного размножения развивалась одновременно и во взаимосвязи с технологией культивирования in vitro [2-4, 9, 12]. Можно выделить следующие основные вехи в ее становлении как раздела физиологии и биотехнологии растений: проведение первых экспериментов по выделению и поддержанию жизнеспособности растительных клеток австро-германским физиологом растений Готлибом Хабер-ландтом в конце XIX в. и выдвижение им в 1902 г. теории тоти-потентности, то есть способности

отдельных растительных клеток развиться в целый организм. Работы 1910-х и 1920-х гг. по созданию асептической культуры корней американским ученым Вильямом Роббинсом и германским физиологом Вальтером Котте; исследования 1930-1940-х гг. научной школы Калифорнийского института технологии и других мировых центров в области асептической культуры почек и побегов впервые позволили стандартизировать компоненты сред и условия выращивания in vitro. В 19301960-х гг. появилась теория неограниченного роста растительных тканей в условиях in vitro, а также теоретических и практических основ гормонально-регулируемого каллусо- и органогенеза, становление и оптимизация техники микроклонирования in vitro (работы американских, французских и германских физиологов П. Но-беркорта, Ф. Р. Уайта, Р. Ж. Готре, Ж. Мореля, Ф. К. Стюарда, Ж. Рей-нерта, Ф. Скуга, И. К. Кукинга, И. К. Васил, В. Васил, Т. Мураши-ге, П. Махешвари, С. Г. Мукхерджи, А. К. Хильдебрадта, А. Ж. Рикер, Т. А. Тхорп). В 1950-1980-е гг. происходило бурное развитие методов in vitro и микроклонального размножения как нового раздела физиологии растений, характеризовавшееся интеграцией разработанных подходов в исследовании морфогенеза и эмбриогенеза растений, фитогормональной регуляции (открытие цитокининов), первичного и вторичного метаболизма, генетической трансформации, организации внутриклеточных структур и др. С конца 1980-х гг. по настоящее время интенсивность фундаментальных исследований в области культур in vitro и микроклонального размножения снижалась на фоне их

Рис. 1. Примеры использования технологий микроклонального размножения растений на базе белорусских научных биотехнологических школ

A. Индукция морфогенеза и развитие растений-регенерантов гладиолуса сорта Диво Дивное

из латеральной меристемы почки клубнелуковицы (слева) и меристемы клубнепочки (справа). ЦБС НАН Беларуси

B. Рододендрон гибридный сорта HelsinkyUniversity (слева) и высокопроизводительная культура его микроклонов на питательной среде WPM с добавками 5 мг/л И6-(2-изопентил) аденина и 1 мг/л индолил-3-уксусной кислоты. ЦБС НАН Беларуси

C. Растения каттлеи гибридной (Cattleyahybridum), полученные при помощи семенного размножения in vitro (слева) и микроклоны чубушника венечного (Phlladelphus coronarius), готовые к выведению ex vitro (справа), культивируемые на среде WPM и Orchimax. Биологический факультет БГУ

D. Микроклоны дуба черешчатого Quercusrobur L.) и липы сердцевидной (Tilia cordata Mill.)

в стерильной культуре, полученной в Институт леса НАН Беларуси (справа и слева соответственно)

интеграции в практические разделы биологии и коммерческую биотехнологию.

Научные и практические центры микроклонального размножения растений существуют в Беларуси, Российской Федерации, Украине, Казахстане, Туркменистане, Молдове и других государствах постсоветского пространства [1-2, 6, 11, 15]. Исторически их развитие связано с работами 1960-х гг. научной школы Р. Г. Бутенко, создавшей в Институте физиологии растений РАН первую и крупнейшую в СССР школу культур клеток, тканей и органов растений [2, 4]. В нашей стране пионерами микроклонального размножения растений были Т. И. Фоменко (Центральный ботанический сад НАН Беларуси), Н. А. Картель

(Институт генетики и цитологии НАН Беларуси) и А. В. Кильчев-ский (Белорусская государственная сельскохозяйственная академия, г. Горки) [3]. Сегодня основными центрами микроклонального размножения в нашей стране являются ЦБС [1], Институт леса [5], Институт плодоводства, Институт генетики и цитологии, Гродненский зональный институт растениеводства НАН Беларуси, кафедра клеточной биологии и биоинженерии растений биологического факультета БГУ, Белорусская государственная сельскохозяйственная академия, биотехнологический факультет Полесского государственного университета, Республиканский лесной селекционно-семеноводческий центр, лаборатория микроклонального размножения

картофеля ОАО «Агро-Мотоль», крестьянское фермерское хозяйство «Ягодка», компания ElitKlon и др. На рис. 1 продемонстрированы фотографии микроклонов растений, полученных в некоторых из этих центров.

Можно выделить несколько оформившихся научно и успешных коммерчески направлений использования культур in vitro и микроклонального размножения растений (рис. 2) [2, 3, 6, 9-11, 14].

Более подробно рассмотрим основные стадии микроклонального размножения растений.

Подходы, применяемые для размножения растений in vitro, проиллюстрированы на рис. 3. Они представлены

Рис. 2. Сферы использования метода культуры клеток, тканей и органов растений

кулыус s мер чете и

Рис. 3. Способы размножения и регенерации растений in vitro

множественным побегообразованием из пазушных почек и формированием адвентивных побегов и/или адвентивных соматических эмбрионов, которые могут быть получены напрямую из экс-планта (части ткани или органа исходного растения), непрямым способом из недифференцированных клеток (суспензионной культуры) или тканей (каллусных культур) или из частично дифференцированных каллусных тканей, а также из пропагационных телец (протокормов или псевдоклубней) [2-4, 9]. На практике для большинства растений используется первый метод, однако

для некоторых доступны только второй и третий. В одной культуре могут наблюдаться несколько способов побегообразования и эмбриогенеза.

Существуют 2 подхода для преодоления апикального доминирования и индукции роста боковых побегов: горизонтальное культивирование интактных побегов на питательной среде (размножение отводками in vitro или in vitro layering) и субкультивирование частей побега, содержащих одну или несколько пазушных почек (рис. 4). При переносе на свежий субстрат листья обычно удаляются: таким образом, эксплант

представляет собой участок стебля, несущий одну почку или более.

Основные технические аспекты микроклонального размножения растений

Микроклональное размножение в большинстве случаев включает 3 последовательные стадии: получение асептической культуры; мультипликацию, то есть увеличение количества/размножение пропагул; подготовку для адаптации микроклонов в почве [12]. Дополнительно можно выделить подготовку маточных растений к получению из них первичных

эксплантов для введения в культуру in vitro, а также завершающую стадию адаптации клонированных растений к условиям ex vitro [9, 15]. Таким образом, можно рассматривать 5 стадий данной технологии.

Подготовка маточных растений

Ключевая задача данной стадии — снижение потенциального содержания микроорганизмов (главным образом, грибов) в будущем экспланте, облегчение доступа к меристемам, увеличение их размеров и жизнеспособности [3, 4, 9, 15]. В этой связи для некоторых видов, например для древесных растений, часто используется так называемая выгонка молодых побегов непосредственно перед выделением эксплантов -молодых почек, верхушечных

побегов и сегментов стебля, содержащих меристемы [3]. Для травянистых форм часто создается первичная культура целых растений из семян, что значительно повышает эффективность дальнейших этапов получения высокопроизводительных систем размножения [9]. Такой подход применяется для асептических культур арабидопсиса (Arabidopsis thaliana L.), рапса (Brassica napus E.H.L.Krause), томатов (Solanum lycopersicum L.), декоративных орхидных (Phalaenopsis spp.) и др.

Введение растений в асептическуюкультуру (этап I)

На данном этапе осуществляется стерилизация растительного материала и перенос

на питательные среды изолированных эксплантов, которые дают рост микрорастениям или недифференцированной защитной ткани — каллусу [2, 3, 9]. Обычно первичный прирост наблюдается в период от 3-10 суток (травянистые) до 1-3 месяцев (древесные) [3, 12]. Задача этапа — получение стерильных и жизнеспособных эксплантов, способных к росту и развитию in vitro. Для некоторых растений достижение необходимой степени стерильности или развитие в таких условиях оказывается невозможным. Данный феномен называется реданд-ностью к культивированию in vitro. У многих древесных растений, таких как дуб, ель, сосна и др., этот показатель высок, что связано с большой развитостью микоризных грибов внутри их тканей.

Рис. 4. Варианты индукции роста боковых побегов. Вверху: горизонтальное культивирование, внизу: субкультивирование частей

Одним из центральных вопросов на этой стадии является подбор обработок [9, 10, 15] для стерилизации, которая часто проводится в несколько этапов. Первично экспланты промываются растворами, содержащими детергенты и фунгициды. Продолжительность этой стадии занимает от 15 мин до нескольких часов. Затем производится обработка мощными биоцидными препаратами. Для этого применяют гипохлорит (10-40%), спирт (20-100%), хлорид ртути (0,2-2%), сульфат меди (0,2-2%), перекись водорода (1-20%), нитрат серебра (0,1-2%) и другие вещества в концентрациях, вызывающих гибель грибов и бактерий, но не убивающих растения. Обработки могут быть импульсными (от 10 с до 1-2 мин) или продолжительными (до 1 ч), часто они комбинированные и последовательные. Большая проблема на данной стадии — гибель и повреждение эксплантов. Подбор стерилизаторов может занять до 1 года, а в некоторых случаях он так и не завершается успехом. Серьезные затруднения при введении растений в культуру вызываются внутренней инфекцией/ контаминацией, то есть развитием грибов или бактерий внутри экс-планта, имеющего ослабленный иммунитет. На фоне высокого содержания сахаров микроорганизмы часто размножаются ускоренными темпами. Таким образом, борьба с внутренней инфекцией часто становится сложной и порой непреодолимой проблемой.

Составы специализированных сбалансированных минеральных сред, таких как «Мура-сиге и Скуга», «Као и Михайлю-ка», «Гамборга», «Ллойда и Мак-коуна», «Линдсмайера», «Нитша», «Литвая», «Орхимакс» и др., были

разработаны под определенные протоколы культивирования in vitro, виды растений и особые типы экспериментов [2-4, 10, 15]. В зависимости от особенностей объекта и его отзывчивости к условиям in vitro в среды могут вводиться различные фитогормоны. Очень часто используются ци-токинины (0,05-5 мг/л кинети-на, 6-бензиламинопурина, зеа-тина или др.), так как они стимулируют рост побегов в культуре in vitro, блокируя рост корневой системы. Также могут добавляться вещества, такие как витамины и источники природной органики (дрожжевой экстракт, кокосовая вода, картофельный отвар, фруктовые соки, меласса, патока и др.), которые для некоторых культур стимулируют процессы роста и развития. Однако добавки, имеющие неизвестный состав, снижают возможности стандартизации исследований и биотехнологических производств.

Мультипликация, увеличение количества/размножение пропагул (этап II)

Данная стадия обеспечивает увеличение количества растений в результате их клонирования [2-4, 9]. Это реализуется микрочеренкованием in vitro или индукцией соматического эмбриогенеза — формированием эмбрионов в обычных тканях или предварительно полученном каллусе (реже в суспензионной культуре).

Для сохранения сортовых признаков, которые часто наследуются эпигенетически или только при наличии интактных меристем, часто используется микрочеренкование, поскольку оно обладает меньшей инвазивно-стью и влиянием на структуру меристем, чем соматический

эмбриогенез [3-4, 10, 15]. Однако микрочеренкование отличается невысоким коэффициентом раз-множения/пропагации. Обычно для древесных растений можно получать 4-5 микроклонов из одного в течение 1,5-3 месяцев, то есть при дальнейшем субклонировании («расклоне») около тысячи микроклонов за год. В реальности эта цифра значительно ниже, так как происходит выбраковка растений, зараженных при пересадке, наблюдается непредсказуемое снижение скорости роста, повреждение растений или даже их синхронная гибель (характерно для редандных древесных видов). Для многих травянистых культур используется соматический эмбриогенез, обычно демонстрирующий более высокие коэффициенты размножения [7, 9]. Для некоторых растений возможно образование эмбриогенного каллуса. Каллусогенез обычно стимулируется фитогормональ-но — равными высокими уровнями ауксинов и цитокининов. Перевод растений в дальнейшем на безгормональную среду или среду с невысоким уровнем цитокининов приводит к формированию в каллусной ткани эмбрионов. Полученные микроклоны могут пересаживаться на новые среды или выводиться в условиях ex vitro (рис. 2).

Подготовка для адаптации микроклонов в почве (этап III)

Перед выведением растений в условия ex vitro необходимо простимулировать рост корневой системы [3-4, 12]. В случае размножения микрочеренкованием все чаще используются безгормональные среды, позволяющие формироваться у микроклонов корневой системе.

При соматическом эмбриогенезе из ткани или каллуса (рис. 3) может понадобиться индукция формирования корневой системы, что достигается переводом про-пагул со сред, содержащих цито-кинины, на безгормональные или содержащие ауксин (0,05-5 мг/л) среды [2, 7].

Так или иначе подготовка к адаптации связана с получением относительно крупных, жизнеспособных и имеющих корень микрорастений. Хотя имеются методики использования растений без корней, они обычно не применяются на практике, так как дают низкий выход жизнеспособных растений. Иногда используется снижение уровня минеральных солей и концентрации сахарозы [2-4]. Однако такой прием «преадаптации» требует дополнительных трудоемких манипуляций и его эффективность обычно невысока.

Адаптация микроклонов к условиям ex vitro (завершающий этап)

Производится открывание культивационных сосудов и прекращение использования стерильных условий. Растения отмываются от гелевой среды и в большинстве случаев обрабатываются кор-нестимуляторами, содержащими ауксины (10-200 мг/л). Затем они высаживаются в твердый субстрат, который может иметь разнообразный состав: торф, вермикулит, перлит, диатомит, керамзит, песок и др. [3-4, 9]. В большинстве случаев подбирается их смесь. Например, часто используются торф с вермикулитом в соотношении 1:1, 1:2, 2:1, торф, песок и вермикулит — 1:1:1, 1:1:3 и др. Субстрат может стерилизоваться в автоклаве, что всегда способствует лучшему выживанию

и укоренению микрорастений, однако это не всегда экономически целесообразно в условиях крупных питомников с большими объемами производства. В течение 2-10 суток после перевода в условия ex vitro микроклоны помещаются в условия повышенной влажности воздуха, что позволяет побегам лучше адаптироваться [2-4, 15].

Стадия перевода в условия ex vitro часто является лимитирующей для микроклонально-го размножения растений [2-5]. Осмотический и механический стресс, а также заражение грибами и бактериями может элиминировать до 100% микроклонов при их адаптации (обычно эта цифра составляет более 50%). Растения при этом ослаблены, их устьич-ный аппарат недоразвит, они поначалу не способны самостоятельно производить сахара и другие метаболиты [2-5, 9, 15]. Поэтому на данной чувствительной стадии могут быть использованы биоциды (фунгициды), адапто-гены (брассиностероиды, корне-стимулирующие и фунгостатиру-ющие бактерии), антиоксиданты (L-аскорбат, восстановленный глу-татион и др.) [3, 9, 15]. Для различных растений эффективность обработок этими агентами разнится, но в целом при тщательном их подборе отмечается положительный результат.

Проблемы, возникающие при микроклональном размножении растений

Каждый из этапов технологии микроклонального размножения сопряжен с определенными техническими трудностями. Некоторые виды, экотипы и сорта растений редандны к культивированию

in vitro, часть их не может дать жизнеспособные экспланты при стерилизации ввиду внутренней инфекции [3-5, 10, 15]. Распространенной проблемой является контаминация ввиду потери стерильности системы в процессе культивирования. Иногда наблюдается подавление роста и гибель эксплантов вследствие накопления ингибиторов фенольной природы, в этом случае используются добавки антиоксидантов, активированного угля, культивирование в жидкой среде, пересадки на свежие среды [2-4]. При длительном культивировании может наблюдаться витрификация побегов (повышенное содержание воды), подавление пролиферации пазушных меристем, формирование каллуса и побегов с измененной морфологией и др. [2-4, 9, 10, 15]. При переводе в условия ex vitro часто происходит поражение грибами (реже бактериями), стрессированными при смене условий культивирования растений, остановка роста клонированных образцов, модификация их развития и др. [10, 15].

Исключительно важной проблемой микроклонального размножения, лимитирующей использование данной технологии, являются стабильные изменения физиологии, анатомии и генетики растений при прохождении стадии каллуса или суспензионной культуры перед индукцией соматического эмбриогенеза [3, 5, 14]. В этом случае очень часто наблюдается дварфизм (карликовость) и устойчивые аномалии развития, многие сорта декоративных растений при этом утрачивают ценные фенотипи-ческие признаки.

Предложены многие альтернативы микроклонам (пробирочным

растениям) и их классической адаптации. Это сформированные in vitro микроклубни, микролуковицы, микроклубнелуковицы, а также искусственные семена (микрорастения, инкапсулированные в альгинат или другой гель), которые позиционируются как устойчивые к хранению и транспортировке и могут высаживаться в грунт без адаптации [2, 9, 10, 15]. Технологии производства и использования искусственных семян развиваются в основном в Индии и других азиатских странах. Пока сложно произвести адекватную оценку их эффективности, поскольку работы по данной тематике не представлены в авторитетных рецензируемых журналах. Также важно заметить, что такая техника производства практически не нашла применения в Голландии, США, Германии и в других странах — мировых лидерах в области биотехнологии растений.

Немаловажным лимитирующим фактором является и то, что технология микроклональ-ного размножения более затратна по сравнению с традиционным вегетативным размножением. Кроме того, для ее реализации требуется опытный и высококвалифицированный персонал, специализированное оборудование и дорогостоящие реактивы. Несмотря на попытки обеспечения автоматизации отдельных операций, данная технология предполагает значительную долю ручного труда.

Перспективы развития микроклонального размножения растений в Беларуси

В нашей стране важно сохранить и расширить существующие научные школы в области

микроклонального размножения и экспериментальной биологии растений в целом. Владение данной технологией открывает для Беларуси серьезные перспективы в важнейших разделах биотехнологии растений. Об этом свидетельствует постоянное увеличение количества коммерческих частных компаний, использующих технику микроклонального размножения. В будущем несомненный интерес будут представлять работы с использованием техники микроклонирования для генетической трансформации и оздоровления сельскохозяйственных растений. Среди актуальных направлений для нашей страны в области микроклонального размножения можно также отметить создание банков

культур отдельных исторически важных и плюсовых растений. Особое внимание будет уделяться соматическому эмбриогенезу у хвойных и лиственных лесных древесных видов и автоматизации размножения путем использования биореакторов. Важной перспективой дальнейшего развития техники микроклонального размножения также является внедрение инновационных физиологических и в особенности феномных подходов, позволяющих производить цифровой анализ фенотипа, например ценных декоративных сортов и куль-тиваров [16, 17], что позволит автоматизировать отбор микроклонов в промышленном масштабе и повысит качество селекционного процесса.

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ ИСТОЧНИКОВ

1. Асептическая коллекция и банк ДНК Центрального ботанического сада НАН Беларуси как эффективные инструменты сохранения редких растений / Е. В. Спиридович [и др.] // Весц Нацыянальнай акадэмм навук Беларусь Серыя билапчных навук. 2017. №3. С. 117-128.

2. Бутенко Р. Г. Биология клеток высших растений in vitro и биотехнология на их основе: учеб. пособие / Р. Г. Бутенко — М., 1999.

3. Картель Н. А. Биотехнология в растениеводстве: учебник / Н. А.Картель, А.В. Кильчевский. — Минск, 2005.

4. Катаева Н. В. Клональное микроразмножение растений / Катаева Н. В., Бутенко Р. Г. — М., 1983.

5. Падутов В. Е. Методы молекулярно-генетического анализа / В. Е. Падутов, О. Ю. Баранов, Е. В. Воропаев. — Минск, 2007.

6. Решетников В. Н. Биотехнология растений и перспективы ее развития / В. Н. Решетников, Е. В. Спиридович, А. М. Носов // Физиология растений и генетика. 2014. Т. 46, №1. С. 3-18.

7. Advances in conifer somatic embryogenesis since year 2000 / K. Klimaszewska [et al.] // In vitro embryogenesis in higher plants. — Humana Press, NewYork, 2016. P. 131-166.

8. Evaluation of a new temporary immersion bioreactor system for micropropagation of cultivars of eucalyptus, birch and fir / E. Businge [et al.] // Forests. 2017. V. 8. N6. P. 196.

9. George E. F. Plant propagation by tissue culture / E. F. George, M.A. Hall, G. J. De Klerk. 3rd Edition. Vol 1. The Background. Edited by Springer, Dordrecht, The Netherlands, 2008.

10. Loyola-Vargas V. M. Plant Cell Culture Protocols / V. M. Loyola-Vargas, F. Vázquez-Flota. Second Edition. Humana Press Inc., Totowa, NJ. 2006.

11. Modern applications of plant biotechnology in pharmaceutical sciences / S. Bhatia, K. Sharma, R. Dahiya, T. Bera. 1st Edition. Academic Press, 2015.

12. Murashige T. Plant propagation through tissue cultures / T. Murashige, F. Skoog // Annual Review of Plant Physiology. 1974. Vol. 25, N1. P. 135-166.

13. Non-zygotic embryogenesis in hardwood species / E. Corredoira [et al.] // Critical Reviews in Plant Sciences. 2018. P. 1-69.

14. Slater A. Plant biotechnology: The genetic manipulations of plants / А. Slater, N. Scott, M. Fowler. Oxford University Press, 2003.

15. Smith R. Plant tissue culture: Techniques and experiments / R. Smith. 3rd Edition. Academic Press. 2012.

16. Бондаренко В. Ю. Анализ фенотипа декоративных растений с использованием искусственных нейронных сетей: определение таксономических и физиологических характеристик / В. Ю. Бондаренко [и др.] // Журнал Белорус. гос. ун-та. Биология. 2019. №1. С. 25-32.

17. Шашко А. Ю. Разработка системы фенотипирования древесных растений при помощи алгоритмов машинного зрения и спектрального анализа / А. Ю. Шашко [и др.] // Журнал Белорус. гос. ун-та. Биология. 2019. №1. С. 33-44.

Добавить комментарий

Ваш адрес email не будет опубликован. Обязательные поля помечены *